鹅不雅草属、披碱草属、猬战仲彬的生化战标识表记标帜钻研-生物化学与生物学专业论文docx

  鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的生化和标识表记标帜研究-生物化学取生物学专业论文.docx

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  四川农业大学硕士学位论文鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的生化和标识表记标帜研究姓名:申请学位级别:硕士专业:生物化学取生物学指点教师:;张利20040501摘要鹅不雅草属RoegneriaC.Koch、披碱草属ElymusL.、猬草属HystrixMoench和仲彬草属KengyiliaYenetYang是禾本科Poaceae小麦族TnticeaeDumortier四个主要多年生属。很多是优秀的牧草;有些品种还具有麦类做物抗病、抗虫和抗逆等优秀特征,是麦类做物育种很是贵重的种质资本。然而正在这四个属的分类地位、系统亲缘关系和划分上存正在着极大的不合,一曲是禾草学家辩论的核心。本研究旨正在:(1)通过醇溶卵白、随机扩增微卫星多态性(RAMP)和细胞质基因组PCR-RFLP等三种生化和标识表记标帜,切磋鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的属间变异和亲缘关系,从而评价其系统地位;(2)评价醇溶卵白、R AMP和PCR.RFLP等标识表记标帜正在多年生小麦族属、种的系统取分类学研究中的使用前景,为小麦族系统学研究堆集材料。次要成果如下:1.使用酸性聚丙烯胺凝胶电泳(A.PAGE)对鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属19个进行了醇溶卵白电泳阐发,成果表白:属间醇溶卵白谱带变异大于属内种间变异,统一属的醇溶谱带的类似程度大于分歧属间的谱带:间的醇溶卵白带纹正在数量、着色深浅和迁徙率等方面具有较着差别,多态性较高。聚类阐发显示供试鹅不雅草属、披碱草属和仲彬草属各自聚类正在一路,猬草属模式种H patula取披碱草聚为一类,Hduthiei和Hduthieissp.10ngearistata零丁聚类。醇溶卵白标识表记标帜的成果表白鹅不雅草属、披碱草属和仲彬草属别离做为属分类品级处置是得当的,猬草属的系统地位还有待于进一步的研究。因而,醇溶卵白图谱差别能够做为一项目标而正在多年生小麦族动物的生物系统学研究中加以操纵。2.对鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属23个进行了RAMP阐发。成果表白属间变异极大,多态性极高。31个引物组合发生的286条DNA扩增片段均具有多态性。聚类阐发显示鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属各自聚为~类;Roegneria alashanica、R,elytrigioides和R.magnicaespes聚类正在一路:跋扈草属的模式种Hpatula取披碱草属聚类正在一路,而Hystrixduthiei和爿:duthieissp.10ngear括tata零丁聚为一类;形态类似、染色体组不异、地舆分布分歧的聚类正在一路。本研究成果根基上同形态学和细胞学研究成果相吻合,将鹅不雅草属、披碱草属和仲彬草属做为属分类品级处置比力得当,而猬苹属的系统地位有待进一步确认。RAMP标识表记标帜可做为评价多年生小麦族属的遗传多样性和亲缘关系的一种标识表记标帜手艺。3.使用PCR-RFLP手艺对鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属23个和1份外类群共24份材料细胞质基因组DNA进行遗传变异阐发。操纵3个叶绿体和3个线粒体通用引物扩增出片段,然后用15种性内切酶对其进行酶切,共获得356条DNA片段,此中321条具有多态性,占90.2%。成果表白鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属材料存正在属间多态性和种问多态性,遗传类似系数较高。仲彬草属零丁聚为一类,鹅不雅草属R.grandis、R.aristiglumis、R.elytrigioids、R.alashanica、Rmagnicaespes聚为一类,R.caucasica、R。ciliaris、R.amurensis、R.japonens缸聚正在一路。这些成果取醇溶卵白标识表记标帜、RAMP阐发的成果根基分歧。但不分歧的是5个披碱草属材料、3个猬草属材料和1个鹅不雅草属史妇moj/聚正在一路,其缘由可能有:(1)细胞质基因组的遗传体例为单亲遗传,保守性强:(2)查询拜访的基因组的区域较小和取选用的性内切酶较少相关。通过更多的叶绿体和线粒体基因组编码和非编码序列,并选用更多的性内切酶,细胞质基因组PCR—RFLP阐发将会为多年生小麦族系统学研究堆集更多的材料。总之,正在评价小麦族属的系统地位和亲缘关系时,应分析地操纵形态学、生态地舆学、细胞学和生物学等方面的研究成果,才能做出更精确、更趋于天然的分类系统。环节词:小麦族;鹅不雅草属:披碱草属:猬草属;仲彬草属;醇溶卵白;RAMPPCR.RFLP:染色体组;系统地位;亲缘关系。21媒介小麦族TriticeaeDumortier是禾本科Poaceae动物中很是主要的一个类群。该族动物既包罗了世界上主要的一年生粮食做物和工业用做物,如小麦Triticumaestivum、大麦Hordeumwdgare也包罗很多具有经济价值的多年生优良牧草,如老芒麦Elymussibiricus、冰革Agropyroncristatum。小麦族丰硕的多样性和遗传多样性是麦类做物育种的庞大基因库。已成为改良麦类做物高产、优良、抗病虫和抗逆等性状的主要基因资本。鹅不雅草属RoegneriaC.Koch、披碱草属ElymusL.、猬草属HystrixMoench和仲彬草属KengyiliaYenetYang是小麦族的四个主要的多年活泼物类群,是草原和草甸的次要构成成分。很多品种是优秀的牧草,饲用价值极高。如老芒麦等:有些品种还具有通俗栽培小麦和大麦所缺乏但又需要的抗病和抗逆等的基因,如:鹅不雅草R.komoji、老芒麦、猬草Hduthiei对赤霉病和白粉病具有高抗的特征(董玉琛1992;万永芳1995;Waneta1.1997):一些披碱草属、鹅不雅草属抗小麦花叶病WSMV病毒(Sharmaet a1.1984)和大麦锈病(Bothmereta1.1991);有的具有抗盐(Meguire&Dvorak1981)、抗旱和抗寒(Dongeta1.1992)等长处。通过远缘杂交、染色体工程等现代遗传和生物手艺方式,能够将这些优秀性状转移到栽培小麦和大麦的遗传布景中来(Feldman1983,1988;Sears1983;Sharma&Gill 1983;Dvorak&McGuire1990;董玉琛1992;刘大钧1994a,1994b;Jiangeta1.1994)。因而,做为丰硕小麦和大麦遗传多样性的种质资本库,这四个属具有主要的价值。然而,鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的系统地位、属内品级划分、边界以及发源和演化问题,至今比力紊乱。分歧系统学家的看法不合较大,是分类上很难处置的多年活泼物类群。鹅不雅草属RoegneriaC.Koch成立于1848年,而披碱草属ElymusL.是Linneus于1753年成立的。自成立以来,履历过较大的交化。Roegneria的持久被置于广义的冰草属(Agropyron Gaertn.S.1at.)下做异名处置。Nevski(1934)阐述了Roegneria取Agropyron的差别,系统拾掇了Roegneria和Elymus。耿以礼(1959)对中国分布的Roegneria、Elymus和Hystr&进行了系统拾掇。然而,Tzvelev(1976)将Roegneria取Elymus归并,并以Elymus为归并后的属名。L6ve(1984)提出小麦族每一个染色体组应做为属来处置,认为Elymus(包罗Roegneria和Hystrix)具有H和st染色体组。Dewey(1984)的染色体组分类也同意将Roegneria归于Elymus,但指出但指出东亚的很多不含H而含有Y染色体组,而且有StHY染色体组组合的。猬草属的模式种Hystrixpatula Moench具有StH染色体组,Dewey把它并入3到elymus中,但Jenseneta1.(1997)、琴等(2002)报道Hystrix的其它一些具有Ns染色体组,取赖草属(LeymusHochst.)和新麦草属(PsathyrostachysNevski)的Ns染色体组类似。Yen&Yang(1990)以KengyiliagobicolaYenetYang为模式种,成立了仲彬草属KengyiliaYenetYang,具有StYP染色体组。Jensenetal.(1990,1996)报道了鹅不雅草属拟冰草组(RoegneriaSect.Paragropyron)的一些含有取Kengyilia类似的StYP染色体组,故Yangetal,(1991)把这组动物组合到Kengyilia中。近年来,很多学者从细胞学、细胞遗传学、形态学、数量分类、同工酶、RAPD标识表记标帜等方面临Roegneria、etymus、Hystr&和Kengyilia这四个属的系统地位和的亲缘关系进行了研究。本研究旨正在:(1)通过醇溶卵白、随机扩增微卫星多态性(RAMP)和细胞质基因组PCR.RFLP等三种生化和标识表记标帜,切磋鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属属间变异和亲缘关系,从而评价其系统地位;(2)评价醇溶卵白、RAMP和PCR·RFLP等标识表记标帜正在多年生小麦族属、种的系统取分类学研究中的使用前景,为小麦族系统学研究堆集材料。42文献综述2.1鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的分类现状2.1.1鹅不雅草属的分类鹅不雅草属Roegneria是C.Koch于1848年以高加索鹅不雅草R.cablcasicclC.Koch为模式种成立的.是小麦族中最大的属。现知全世界约130余种,次要分布于北半球的温寒地带(Baumeta1.1991)。我国约70余种,次要分布西北、西南和华北地域(耿以礼和陈守良1963;郭本兆1987;蔡联炳1997)。正在成立该属后的很长时间内,人们仍沿用Gaertner(1770)的广义冰草属Agropyron的概念,其时欧、美一些出名学者如Bentham&Hooker(1875)、Hackel(1896)、Hitcheock(1951)等都从意将Roegneria做为Agropyron的异名,这种分类处置一曲影响到后来Bor(1960)的形态分类和Bowden(1965)的细胞学划分。1933年,Nevski正在他的小麦族修订中把1852·1932年间颁发的大部门冰草属和组合(约69个)组合到鹅不雅草属内,并认识到:广义冰草属性状分异过大,宜做平级划分,因此从平分出4个的属:鹅不雅草属RoegneriaC.Koch、花鳞草属AnthosachneSteud.、旱麦草属EremopyrumJaub.&Spach和偃麦草属Etytr捉抽Desv.。翌年,Nevski又撰文系统地描述了鹅不雅草属,而且以外稃芒的曲立或弯曲将该属划分为披碱草组Sect.ClinelymopsisNevski和犬草组Sect,CynopoaNevski。耿以礼(1959)沿袭了Nevski对鹅不雅草属的组、系和种的划分,并添加了一新组:拟冰草组Sect.ParagropyronKeng及一些新系和新种。Yangeta1.(1992)将这组动物组合到了仲彬草属(颜济和杨俊良1990;Yen&Yang 1990)。1963年,耿以礼和陈守良正在《国产鹅不雅草属RoegneriaC.Koch之勘误》一文中,细致阐述了该属的地舆分布、系统演化及其取冰草属模式种的特征差别,汜载了中国鹅不雅草属60余种,对原报道的一些裸名类群补做了拉丁描述,从底子上填补了我国鹅不雅草属分类的空白,为后来《中国动物志》鹅不雅草属部门的编写奠基了根本。正在欧洲,Melderis(1953)和L6ve(1961)最后也认可鹅不雅草属,但后来改变了概念。Tzvelev(1976)将鹅不雅草属取披碱草属归并,并以Elymus为归并后的属名,并正在“Poaceae USSR”中将Roegne—aSect.Clinelymopsis做为EtymusSect.Clinelymopsis(Nevski)Tzvel。,将RoegneriaSect.CynopoaNevski做为ElymusSect.Goulardia(Husn.)Tzvel.的异名。L6ve(1982,1984)同样将Roegneria做为Elymus的异名,提出了每一个染色体组组合该当做为一个属来处置,正在Elymus中(包罗Roegneria)含H和st染色体组。虽然Dewey(1984)的染色体组分类也同意将Roegneria归于Elymus,但指出东亚的很多不含H而含有Y5染色体组,而且有StHY染色体组组合的。陈守良等(1987;1989)通过表皮微形态和形态的数量分类认为Roegneria应归于Elymus中。Tzvelev、L6ve和Dewey等人广义的Elymus概念.曾一度获得很多学者的认同(Barkworth&Dewey 1985:Hsiaoeta1.1986:Lueta1.1990,1991,1993;Lu&Bothmer1990,19927Jensen1990,1996;Bothmereta1.1991;卢宝荣1997),但并未获得人们的遍及采取。Baumeta1.(1991,1995)提出Roegneria同近缘属的天然边界,列出了Roegneria取Agropyron、Elymus和elyt,./g/a的区别特征.理清了过去合并处置中呈现的鹅不雅草属各个种的异名。Jaaska(1992)利用6种同工酶阐发了分布于欧亚、、等的60个Elymus(广义),认为应划分为较小的类群,才能反映这些类群的素质。杨锡鳞等(1990)操纵形态学、细胞学、剖解学以及同工酶等方式,均了Roegneria是一属,并提出了Roegneria新分组看法。朱光华等(1990)通过同工酶阐发了Roegneria和Elymus属界划分。蔡联炳(t997)认为Roegneria具有狭长的花序、延长的穗轴节闯、纤瘦的单生小穗、无脊披针状的颖以及逐节零落小花等形态特征,脚以形成该属取临近属的分界。蔡联炳(2000)通过16个有代表性的种的叶表皮微形态研究,进一步了鹅不雅草属共族分属以及属下类群划分的准确性。细胞学研究表白Roegneria大多为2n=4x=28.其根基染色体组为StY,如R.caucasica、R.ciliaris、R,pendulina、R.hondai等(卢宝荣等1988,1990a,1990b:孙根楼等1991,1992:Jensen&Wang 1991):一些为2n=6x=42,染色体组为StHY,如R.妇moji、R.drobovii、R.schrcnkiana等(Sakamoto1964a,1964b:Sakamoto&Muramatsu1966b:卢宝荣等1990b:Lu&Bothmer1992);也有StStY的R.tschimganica和R.glaucissima(Lueta1.1993)。等(1999)用RAPD标识表记标帜阐发了Roegneria26个的种间关系,其成果根基上取形态学、细胞学和同工酶等阐发的成果分歧。2.1.2披碱草属的分类披碱草属ElymusL.自1753年林奈Linneus成立以来,已经有过多次大的变更,其分属边界也有很大的差别。按照汗青上分歧分类学家的处置,披碱草属已经包含了冰草属AgropyronGaertn.、猬草属AsperellaHumb.、带芒草属TaeniatherumNevski、鹅不雅草属RoegneriaC.K0ch、赖草属LeymusL.和偃麦草属ElytrigiaDesv.(Linneaus1753:Bentham1881;Gould1947:Hitchcock1951:Runemark&Heneen1968)。该属也曾被处置为只包含20~30个的小属(Nevski1934:Baumeta1.1991)。近年来,从细胞学、细胞遗传学、形态剖解学、数量分类、同工酶和标识表记标帜等方面临该属动物进行了大量的研究(Dewey1984:1985;陈守良和徐克学1989:Jaaska1992;Lu61993;Baumeta1.1995;1998)。目前不合较大的分类处置仍然是将披碱草属和鹅不雅草属归并为一属,即Elymus(L6ve1984:Dewey1984:Lu1993:Jensen1996),仍是将其划分为两个的属(耿以礼和陈守良1963;Tzvelev1976;郭本兆1987;Baumeta1.1991;蔡耿炳1997)。基于形态学的保守分类,披碱草属取鹅不雅草属的区别正在于:披碱草属每一穗轴节上着生两个小穗,而鹅不雅草属的每个穗轴节上仅着生一个小穗。近年来,使用细胞遗传学方式。这种分类概念是不得当的。保守的披碱草属中,含StH染色体组的,正在每一穗轴节上既有单小穗的,如犬草Ecaninus:也有两个小穗的,如E.sibiricus。从细胞遗传学的角度看,鹅不雅草属的模式种高加索鹅不雅草尺.caucasica具有StY染色体组;而披碱草属的模式种老芒麦Esibiricus具有StH染色体组,形成了这两个属的次要差别。等(1999a)操纵RAPD手艺阐发了10种披碱草属种间关系,研究成果表白Esibiricus和Ecaninus亲缘关系较近,支撑把Roegneria caninus归入Elymus中。按L6ve(1984)和Dewey(1984)染色体组分类处置,广义披碱草属包罗了形态上每穗轴节含l至少个小穗,颖呈披针形或卵状披针形,每小穗含多枚小花,小花药,白花传粉的多年生。正在这个属的定义下,披碱草属正在全世界共有150余种,包含有StH、StY、StHY、StYP、StYW染色体组的,是小麦族中最大的属。次要分布区正在欧亚、南洲及大洋洲,非洲北部也有少量分布。其垂曲分布从海拔几米至5200米以上的喜马拉雅山区。正在中国,很多禾草学者则接管狭义披碱草属概念,约有12余种(耿以礼1959,1963;郭本兆1987;蔡耿炳1997:刘亮1994)。2.1.3狷草属的分类1790年Humbold以的Etymushystr髓L.为模式成立了猬草属Asperella。因为取稻亚科的假稻属LeersiaSwartz.(1788)的异名AsprellaSchreb.(1789)附近,使得Moench(1794)把Linneus(1753)描述的ElymushystrixL.由于其颖强烈退化以至缺失的特点而为一个属——猬草属Hystrix这个新属名成立,其模式种为Hystrix patulaMoench。正在亚洲过去多利用Asperella,而欧洲和则多利用Hystrix。从此当前,报道了Hystrix约11个种,中国有3个种(Hitcheock1951:Pilger1954:Bor1960;Tzvelev 1976,1983:郭本兆1987:Osada 1989:Baden et a1.1997)。Sakamoto(1973)研究了小麦族各属,认为Hystrix是一陈旧而无效的属,形态和生境取Elymus差别较大。因为Hpatula的染色体组为StH,Dewey(1982,1983,1984)把Hystrix处置为Elymus。但Jensen(1993)、Jeseneta1.(1997)报道/-Ecoreatla和t1.californica具有赖草属Leymus的NsXm染色体组,使得Hystrix的分类更为复杂。琴等(2002)7报道了Itduthieissp.10ngearistata含有Ns染色体组,取赖草属Leymus和新麦草属Psathyrostachys的Ns染色体组类似。并操纵RAPD和ISSR标;己所得的成果取Jesseneta1.(1997)从细胞学得出的成果分歧,支撑将且coreana组合到Leymus中。Badeneta1.(1997)把Hystrix处置为6个种3个变种。目前Hystrix属的边界和它的分类单元一曲处于辩论之中,其核心次要是把这些置于Hystrix(郭本兆1987:Watson&Dallwitz1992:Czerepanov 1995:Bodenet a1.1997):仍是做为广义Elymus的一部门(L6ve1984;Dewey1984;Barkworth1993)以及仍是放正在Leymus中(Jensen1993;Jeseneta1.1997)。2.1.4仲彬草属的分类仲彬草属(以礼草属)Kengyilia是颜济、杨俊良于1990年以发展于石质沙漠中的沙漠仲彬草脚gobicolaYenetJ.L.Yang为模式种成立的,其形态介于Roegneria和Agropyron之间(颜济和杨俊良1990:Yen&Yang1990)。取RoegneriaSect.CynopoaNevski的区别正在于:穗状花序的穗轴短缩,陈列慎密,上部穗轴节间长1.5.3毫米,稀可长达4毫米,顶端小穗有时发育不全,外稃密生柔毛或糙毛,顶端具短芒或无芒。取Agropyron有亲缘关系,惟其颖取外稃扁平或背部呈圆形无显著之脊,故取该属有区别。这取耿以礼等(1959)以梭罗草R.thoroldiana(Oliv.)Keng为模式种成立的Roegneria Sect.Paragropyron具有类同的特征。正在这组动物的分类品级的划分和归属上,存正在较大不合。L6ve(1984)将该组动物放正在ElymusSect.Goulardia中。Jensen(1990a,1990b,1996)也将其放入elymus中。郭本兆(1987)正在《中国动物志》中承继了耿以礼和陈守良(1963)对这类动物的处置,将它们放入Roegneria中。Yangeta1.(1992)则把它们组合到Kengyilia中。陈守良等(1991)也附和将这组动物组合到Kengyilia中,更正了该属中各类名,并从叶表皮微形态的角度切磋了该属动物的系统和属间亲缘,猜测该属是源于鹅不雅草属,向冰革属演化的一个纽带类群。蔡联炳(1997)认为把鹅不雅草属拟冰草组归于仲彬草属削减了鹅不雅草属品种纷繁、性状错乱和生态多样的分类弊病。并于1999年从形态上拾掇了仲彬草属,以花序粗厚,穗轴简短,小穗短缩,颖卵状披针形或长圆形,背部略显脊,外稃被长毛,芒凡是短于稃体等性状做为该属的特征。提出一个新的分类系统,新系统包罗3组、26种、6变种。Baum、颜济、杨俊良、蔡联炳等(1995)先后颁发了10余个新种和新组合。到目前为止,全世界共23种9变种。多分布于中国、前苏联及邻国,大多分布于帕米尔高原、喀喇昆仑山脉、阿尔泰山脉、天山山脉、祁连山脉、喜马拉雅山脉及青藏高原地域。发展于海拔1100~5100米的草旬、草原、荒凉之中(Yanget a1.1992)。8Baumeta1.(1995)从数理形态方面研究了仲彬草属取近缘属鹅不雅草属、披碱草属Elymus和冰草属Agropyron之间的关系。细胞学研究表白:Kengyilia动物为六倍体(2n=6x=42),具有StYP染色体组(颜济和杨俊良1990:Yen&Yang1990;Jenseneta1.1990a,1990b,1996;张新全1997)。Wangeta1.(1994)拟定的国际上小麦族基因组标识表记标帜符号正式认可仲彬草属的基因组为StYP。张利(2003)对仲彬草属进行了核型、RAPD、ISSR、RAMP和ITS序列的变异研究。2.2鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属染色体构成及其发源和演化鹅不雅草属的模式种R.caucasica具StY染色体组,披碱草属的模式种E sibiricus具StH染色体组,跋扈草属的模式种H patula具StH染色体组,而仲彬草属的模式种正gobicola具有StYP染色体组。虽然一些属中还存正在其它染色体组,如猬草属具有Ns染色体组的,对这些需要进行全面的染色体组阐发,并做出响应的分类处置。可是,这四个属根基的染色体组为St、H、Y和P。至于St、H、Y和P根基染色体组的发源问题。Dewey(1982)阐了然Elymus的St染色体组来历于的拟鹅不雅草属Pseudoroegneria的二倍体,H来历于大麦属Hordeum的二倍体种。至于亚洲Roegneria的Y染色体组一曲未知其供体种。Dewey认为该若存正在,那必然正在东亚或喜马拉雅区域,也可能曾经绝灭。正在亚洲,也存正在具st染色体组的,如Pseudoroegneriacognata(SO、Plibanotica(St)、Pelytri{?ioides(Stst);以及H染色体组的,如Hordeumbogdanii、Hroshevitzii及其它二倍体。因此亚洲的发源取的发源可能有差别(Lu 1990)。正在仲彬草属的发源上,Yen和Yang(1990)和Yanget a1.(1992)认为仲彬草属的StY染色体组来历于鹅不雅草属,P染色体组来历于冰草属,而st染色体组则认为源于亚洲的拟鹅不雅草属PseudoroegneriaPcognata和Plibanotica。(1998)操纵RAPD手艺阐发了上述四个属的相关染色体组或组合(StY、StH、St、H、StP、PP、StYP、StHY)的关系,成果表白这四个属的染色体组或组合存正在着较大差别,StY和StHY的关系比来,H和StYP 的关系最远,St和P之间的关系比它们取H的关系更近一些,含St基因组的分歧组合StP、StY、StH(Hystrix)、StH(Elymus)和StYP、StHY取st有必然的关系,可是St取StP的遗传关系比来,从而支撑形态学和染色体组阐发材料把St、StP放正在拟鹅不雅草属Pseudoroegneria中。综上所述,无论从典范的形态学分类仍是从染色体组进行的细胞学分类,Elymus、Roegneria、Hystrix和Kengyilia这四个属的系统地位、属内品级划分、边界以及发源和演化问题,至今比力紊乱,分歧系统学家的看法不合较大。92.3小麦近缘属的醇溶卵白研究小麦籽粒中含有多种不具酶功能性质的储藏卵白,按照其消融特征的分歧分为两大类,即麦谷卵白和麦醇溶卵白。这两种卵白占小麦种子卵白的85%,它们取小麦面粉的烘烤质量具有亲近关系。麦谷卵白取面团的弹性亲近相关,麦醇溶卵白决定了面团的粘着性和延展性。麦醇溶卵白正在布局上为单亚基,具有高度的异质性和复杂性(Payneeta1.1984b)。颠末酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Acidpolyacrylamidegelelectrophoresis,简称A)后,每个小麦品种可分手出15–30条摆布的谱带(Bietz1987)。按照其量的大小和迁徙率的分歧,麦醇溶卵白电泳图谱分为a、B、Y、ca)四个区。遗传研究表白:小麦醇溶卵白的编码基因次要位于第一和第六部门同源群的染色体短臂上,有Gli—l、Gli.2、Gli.3三个位点群,共8个位点,117个等位变异(Payneeta1.1984:McIntosheta1.1993)。分歧醇溶卵白位点间随机组合,使其正在分歧小麦品种间存正在着较着的差别,显示出品种间高程度的多态性。电泳后带纹的几多及组合体例受基因型节制,几乎不受因子的影响。因而,小麦醇溶卵白能够形成品种的“指纹”(Draper 1987)。聚丙烯酰胺凝胶电泳是Raymond和Weintraub于1959年成立的一种方式,1964年Ornstein和J.Davis从理论上和尝试手艺上做了进一步的阐明和改良,此后被逐步推广使用。国际种子查验协会(IsTA)于1986年正式公布了ISTA使用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方式判定小麦和大麦品种的尺度法式,并弥补到《1985国际种子查验章程》中。要求正在全世界范畴内推广和使用(Draper1987)。因为该方式简单、不变,破费少,反复性好,所需供试材料少(一粒或半粒种子即可),近年来,国表里已将醇溶卵白电泳阐发使用到遗传育种和种子出产上,如品种判定、种子纯度查验、亲缘关系阐发、代换系和易位系以及体细胞无性系变异判定、质量预测等方面。小麦族动物的大部门生化标识表记标帜正在属种间存正在着较着的多态性,而正在统一种内分歧的品种或收集材料之间缺乏脚以做为品种特征特征的多态性。麦谷卵白和麦醇溶卵白,出格是麦醇溶卵白,正在小麦族动物的属间、种间、种内分歧居群间存正在较着的差别。张学怯等(1995)操纵酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳对38份收集地分歧的节节麦Aegilopstauschii进行了醇溶卵白遗传阐发,认为麦醇溶卵白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳手艺做为资本判定的无效手段,有可能用于处理收集资本材料的反复问题,提高麦类做质资本保留和操纵的效率:同时,能够用于研究某些小麦近缘属的发源和演化。兰秀锦等(1999)用同样的方式阐发比力了中国节节麦取中东节节麦的醇溶卵白遗传多样性,支撑了中东为节节麦的发源核心学说。周等(1996)研究了新麦草10Psathyrostachys juncea分歧粒数种子的醇溶卵白(G1i-1),表白1~4粒种子的醇溶卵白谱带较少,分辩率较好,5.14粒种子的谱带具有很强的多态性。杨瑞武等(2000) 对披碱草属12个进行了醇溶卵白阐发,表白间的醇溶卵白图谱差别可以或许反映必然的系统关系。杨瑞武等(2001)阐发了小麦族鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属4个模式种醇溶卵白遗传变异,成果表白4个模式种具有较着的醇溶卵白遗传多样性。做为一种生化标识表记标帜,醇溶卵白将正在小麦族动物的生物系统学关系研究及操纵小麦族遗传资本进行麦类做物育种中阐扬感化。2.4DNA标识表记标帜正在小麦族系统关系研究中的使用遗传标识表记标帜是遗传物质特殊的易于识此外表示形式。当前遗传标识表记标帜次要有4品种型:形态标识表记标帜、细胞学标识表记标帜、生化标识表记标帜和标识表记标帜。形态标识表记标帜指动物的外部形态特征,如株高、穗长、粒色、千粒沉等。此种标识表记标帜简单曲不雅,但形态标识表记标帜少、多态性差、且易受前提的影响。细胞学标识表记标帜次要指染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点等)和带型(c.带、N.带、G.带等),明显这类标识表记标帜的数目也很无限。生化标识表记标帜次要包罗同工酶和储藏卵白,它具有经济便利的特点,但其标识表记标帜数目较少,不克不及满脚种质资本判定的需要。取上述3种标识表记标帜比拟,标识表记标帜具有以下优越性:①间接以DNA的形式表示,正在动物体的各个组织、各发育期间均可检测到,不受季候、,不存正在表达取否的问题。②数量极多,广泛整个染色体组。③多态性高,天然存正在着很多等位变异,不需特地创制特殊的遗传材料。④表示为“中性”,即不影响方针性状基因的表达,取不良性状无必然联系。⑤有很多标识表记标帜表示为共显性,可以或许辨别出纯合基因型和杂和基因型,供给完整的遗传消息。目前曾经开辟了多种基于DNA多态性的标识表记标帜,常用的有:性片段多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,简称RFLP)、随机扩增加态性DNA(random amplified polymorphic DNA.简称RAPD)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,简称AFLP)、微卫星DNA(microsatelliteDNA)又称简单反复序列(sequencerepeat,简称SSR)、随机扩增微卫星多态性(randomamplifiedmicrosatellitepolymorphism,简称RAMP)、PCR-RFLP及原位杂交(insituhybridization)等。2.4.1RAMP标识表记标帜正在动物遗传多样性研究中的使用随机扩增微卫星多态性(randomamplifiedmicrosatellitepolymorphism,RAMP)是wueta1.(1994)提出的一种标识表记标帜手艺,它操纵一条5’端锚定2-4个寡核苷酸取微卫星(SSR)序列互补的引物和一条RAPD的引物组合对基因组DNA中的微卫星进行随机扩增。该手艺操做法式简单,不需要通过克隆、测序来设想特殊双引物,因此避免了SSR手艺的繁琐;部门RAMP扩增片段呈现共显性,合适孟德尔分手纪律,从而也填补了RAPD手艺的缺憾;比RAPD更能间的亲缘关系,适合遗传布景尚不太清晰的遗传多样性研究(Davilaeta1.1999:SanehezdelaHozeta1.1996)。目前,正在转基因水稻、杨树和甘蔗(SalaFetal.2000;ArencibiaADetal.1999) 等的种质判定以及桃(Chengeta1.2001)、鱼腥草(吴卫2002)等动物资本的遗传多样性研究中获得普遍的使用。正在小麦近缘动物的RAMP研究中,仅见使用于栽培大麦Hvulgaressp.vulgare和野生二棱大麦Hvl,dgaressp.spontaneum(Davitaet“.1998,1999)以及黑麦属Secale(尚海英等2003)、仲彬草属Kengyilia(张利2003)和赖草属Leymus(杨瑞武2003)的遗传多样性研究中。2.4.2细胞质基因组PCR-RFLP阐发正在动物系统学中的使用动物细胞质基因组包罗叶绿体基因组(cpDNA)和线粒体基因组(mtDNA)。cpDNA和mtDNA均为大,大大都呈环状,正在某些低等实核生物中也有少量的mtDNA是线性。cpDNA凡是由两个反向反复序列(IR)将一个大的单拷贝区(LSC)和一个小的单拷贝区(SSC)分隔。mtDNA基因序列高度保守,其碱基代换频次远比cpDNA低,可是它的沉排现象十分遍及。目前很多的cpDNA全序列(例如水稻、玉米、地钱、烟草、黑松等)和很多主要的叶绿体基因,例如,rbcL、PsbA、护口HK、rpO、atpB等被测定、克隆和测序,因而已设想出很多引物和通用引物用于扩增cpDNA的编码区和非编码区。mtDNA基因序列很是保守,沉排现象十分遍及,设想出可扩增出非编码序列的通用引物相对较难,但仍有一些内含子和小的间隔基因的区域取进化相关,很是有用,如rpsl4和cob基因。cpDNA和mtDNA的扩减产物可通过两种体例检测,一种体例是扩增后间接测序,另一种是PCR完成后进行酶切,即PCR-RFLP手艺。前者分辩率高,后者操做更便利。两种方式都获得遍及使用。遍及使用于cpDNA变异的手艺包罗:(1)性酶消化后电泳分手:(2)用酶对总DNA进行消化,然后利用cpDNA性探针进行Southern阐发,即所谓的RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism):(3)对epDNA间接测序。这些方式是强无力的东西,但因为它们正在经费、时间和劳力上的耗损都很大,从而了对大大都小片段的阐发(Fona1999),别的还需要进行放射性同位素操做。因而,PCR-RFLP阐发遭到生物系统取进化学家的青睐。PCR-RFLP阐发是对PCR扩增的DNA片段进行酶切位点阐发,正在动物系统学研究方面至多存鄙人述长处;(1)不需提纯cpDNA:(2)毋需利用同位素或其他标识表记标帜物,不受同位素半衰期的,并削减尝试室的污染;(3)省去了繁杂的基因克隆步调,节约大量时间,不需颠末测序却能获得类似的成果:(4)需要的材料少,从少于50 mg的动物材猜中提取的总DNA即可满脚PCR反映的需要量,颠末20~25个轮回,理论上能够将靶序列扩增约106倍,即可检测出正在总DNA中存正在1/10”量单拷贝靶序列:(5)对于动物材料要求不严酷,新颖叶、快速干燥叶或保留较好的化石叶均可用于总DNA提取;(6)因为扩减产物的性,使得阐发成果更靠得住。动物mtDNA因为长度突变和序列沉排发生屡次,使之难以找到取酶切位点比力婚配的同源序列,设想出可扩增出非编码序列的通用引物相对较难,正在RFLP阐发中遭到很大.但近年来动物线粒体的使用有进展。目前已普遍地使用于动物系统发育(Demesureeta1.1995;Tsumuraeta1.1996:Fonaeta1.1999;何兴金等2000)、居群遗传(Mohantyeta1.2000:Domulin.Laeta1.1997)和判定(Parduccieta1.1999;Wangeta1.2000.Paranieta1.2001)。3材料取方式3.1供试材料用于醇溶卵白标识表记标帜的材料列于表1。用于RAMP阐发和PCR.RFLP的材料列于表2。表1醇溶卵白标识表记标帜的供试材料序号名赫染色体数目染色体组编号来历●RoegneriacaucasicaKoch勰StYPI531572亚美尼亚2R.elytrigioides(Yen etJ.勰StstZY2001昌都LYang)L.B.Cai3RalashanicaKeng勰St.ZY2003守夏银川4尼kamojiOhwi鸵stYH88_89281四川雅安5Rjaponens缸(Honda)Keng孙StYPr87-88-332四川宜宾6R.ciliaris(Trin.)Nevski勰StY88.892387尼amurensis(Drob.州evskl勰StYPI547303前苏联8勰StYZY3158陕西临潼9ElymussibiricusL.筋stHY2906甘肃合做铊StHHZY2008昌都11Ecaninus(L.)L.勰StHY273012E///liOnSGriseb铊StYHPI49945013HystrixpatulaMoench勰StHPr80.81-398Hduthiei14ssplongearistata强Ns-ZY2005日本京都(Hack)Ohwi15Hduthiei(Stap0Bor弱Ns—ZY2004四川崇州16嚣警玎m印扔。b№”‘42StYPY9503新疆塔什库尔干1—1If.rigidula(Keng)J.L42S£YPW622130甘肃夏河Yang,YenelBaum-s怠。:絮。鬣渊^L42stYPY2873青海格尔木!:兰薹堡竺釜鳖竺:二竺竺兰!二!:!!竺!!!竺堡14表2RAMP和PCR—RFLP阐发的供试材料序号名称染色体数目染色体组编号来历●勰StYPI531572亚美尼亚2Rciliaris(Trin.)Nevski嚣StY88—89.2383Rjaponensis(Honda)Keng嚣StYPr87-88.332四川宜宾4R.amurensis(Drob.)Nevski船StYPI547303前苏联5R grandisKeng勰StYZY3158陕西临潼6RaristiglumisKengetS.L勰StYZY2011昌都Chen7RalashanicaKeng勰St.ZY2003银川RR.elytrigioides(YenetJ.L.。勰stStZY2001昌都Yah曲L.B.CaiRmagnicaespes(D.ECuD7勰st—Y0756新疆库车oL.B.Cai10R.kamojiOhwi铊StYH88.8928l四川雅安11ElymussibiricusL.勰stHY2906甘肃合做12Ecaninus(L¨)L.勰stHY2730,,“ElanceolaB.ts(Scribneret勰stHD.3542美国Smith)Gould14Enutan5Griseb蛇StYHPI499450Etangutorum(Nevski)lE鸵StHHZY2008昌都~Hand.-Mazz16HystrixpatulaMoench勰StHPr80.81-39817Hduthiei(Stapf)Bor勰Ns.ZY2004四川崇州,s笛£笤篇嘉p如增“m招细筋Ns.ZY2005日本京都19Kengyiliagobwo『口Yenet舵StYPY9503新疆塔什库尔干Yang正thoroldianarOliv)J.L20北StYPY2878青海格尔术Yang,YenetBaum21脚mutica(Keng)J.L.Yang,42StYPY2873青海格尔木YenetBaom正melantherafKeng)J.L.2242StYPY2708四川红原Yang,YenetBaum23ang.Yen42StYPW6o221304Kr彬如缸(K。“g)J_LetBaum3.2方式3.2.1醇溶卵白阐发采用ISTA(1986)公布的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH3.1)尺度法式(稍加改良)电泳阐发醇溶卵白(Draper1987;张玉良等1994;王学等1994)。电泳仪器为六一仪器厂的DYY–J/12型电泳槽。具体方式如下:(1)样品提取:每份材料取5粒种子称沉,用钳子夹碎后放入1.5 mL离心管中,按1 mg加5乩的比例插手样品提取液(25%2-氯乙醇+O.05%甲基绿),振荡器上振荡混匀,室温浸提留宿。利用前10000r/rain离心10rain。取上清液点样。(2)溶液配制:凝胶缓冲液(1L)一冰醋酸20mL、甘氨酸19:凝胶溶液(1L)一丙烯酰胺100g、N—N甲叉双丙烯酰胺5g、尿素60g、抗坏血酸lg、硫酸亚铁0.04g,溶于凝胶缓冲液中;10×电极缓冲液(1L)一冰醋酸40mL、甘氨酸4g,利用前稀释10倍。(3)制备凝胶:凝胶溶液35mL、10%过硫酸胺35此、TEMED35laL,敏捷摇匀,灌胶,插好梳子。(4)加样:小心拔出样品梳,用电极缓冲液冲刷加样孔。每个样品上样量为10此。(5)电泳:恒压500 V、恒温10~15℃,电泳时间为甲基绿前沿剂迁徙至板底所需时间的3倍。(6)染色:每块凝胶吸收5mL1%考马斯亮蓝R250,再加10%三氯乙酸200mL染色。7.0%醋酸中保留,统计。摄影。3.2.2RAMP阐发(1)总DNA提取:每份材料取6~】0株动物的长嫩叶片约3g,研磨成粉末,放入50ul离心管中,插手预热(65℃)的20ml缓冲液(100mmol/LTris.CI,pH8.5;50mmol/LEDTA,pH8.0;100mmol/LNaCI:2%SDS),充实混匀。将离心管置于65℃水浴l~2h,水浴过程中暖和地混匀几回。取出离心管,再插手5mol/LKAe5ml,小心混匀,再插手等体积的氯仿:异戊醇=24:1(v/v),小心混匀。冰浴20min,离心,3000rpm,20 rain。取上清液于另一离心管中,插手0.6倍体积的异丙醇,悄悄混匀,置于冰上30min沉淀DNA。勾出DNA,用70%乙醇洗2~3次,气干。插手适量lxTE消融DNA(插手100ugRNase,以除去RNA)。Phamacia公司LKBultroscpec紫外分光光度计以OD260测定DNA浓度,用OD260/OD280比值检测核酸纯度。4C冰箱中保留备用。16(2)RAMP反映:随机选用5’锚定的引物即OC(CA)4和GT(CA)4取美国Operon公司出产的A、B、H个R组80个十聚体随机引物构成的160个组合(表5)。PCR扩增反映正在25雎l反映系统中进行:l×PCRbuffer(Ommol/LTris—HCIpH8.3,50mmol/LKCl,O.001%gelatin)。2.0mmol/LMgCl2,100gmmol/L,20ng模板DNA,1UTaqDNA聚合酶(上海Promega公司),上覆25“l液体白腊油。反映正在PTC.200PCR仪上按下列法式进行:94。C预变性4min,每轮回中94’C变性1min,42。C退火1min,72C延长2min,共45个轮回。完成最初一个轮回后,正在72。C保温10min。(3)扩减产物检测:以1xTAE为缓冲液,将扩增后的样品加5HlLoadingbuffer,正在含有O.1%溴化乙锭(EB)的2%琼脂糖凝胶上电泳分手。GelDoc2000(Bio—Rad) 凝胶成像仪上察看、、记实。3.2.3POR-RFLP阐发(1)总DNA提取:取用于RAMP反映的DNA的提取方式不异。(2)PCR—RFLP反映:利用上海生工生物工程公司合成的3个叶绿体和3个线粒体通用引物用于PCR反映,其名称、序列、扩增区域取片段大小及参考文献出处列于表3。PCR反映正在25ul反映系统中进行:l×PCRbuffer(10mmol/LTris-HCIpH8.3,50mmol/LKCI,0.001%gelatin),1.5mmol/LMgCl2,100lammol/L。20ng模板DNA,1UTaqDNA聚合酶(上海Promega公司),上覆25¨1液体白腊油。反映正在PTC·200PCR仪上按下列法式进行:94。C预变性4min,每轮回中94C变性lmin,53*(2退火lrain,72。C延长2min,共45个轮回。完成最初一个轮回后,正在72C保温10min。表3细胞质基因组PCR.RFLP引物序列及其来历17(3)扩减产物的酶切和电泳:扩减产物间接用于电泳阐发,正在此中插手Ava I、BamHI、EcoRI、EcoRV、Ecll36II、HaelII、Hin6I、t4poII、HinfI、lCpnI、nfI、RsaI、TaqI、XbaI和XhoI等15种性内切酶,正在厂家供给的最适酶解温度下酶解2~3小时。然后,插手适量上样缓冲液后点样,正在含有0.5%EB和2.O%琼脂糖凝胶中电泳,GelDoe2000(Bio.Rad)凝胶成相仪上察看、成像、记实。3-3数据统计取阐发3.3.1醇溶卵白标识表记标帜计较酶带的相对迁徙率Rf(Rf=酶带迁徙距离/甲基绿迁徙距离)。统计各个材料的酶带数及其酶带迁徙率Rf。每个样品条带按二元数据记实,有带记为l,无带记为0。按Nei&Li(1979)方式计较材料间遗传类似系数(GS)。计较公式为:GS=2Nij/(Ni+Nj),此中NU为材料i和j共有的扩增片段数目,Ni为材料i中呈现的扩增片段数目,Nj为j材猜中呈现的扩增片段数目。按照遗传距离(1.GS)按不加权成对群算术平均法(UPGMA)进行遗传类似聚类。统计阐发正在NTSYS—pc软件系统下运转(Rohlf 1993)。3.3.2 RAMP和PCR-RFLP标识表记标帜将RAMP扩减产物和PCR扩减产物酶切后每个条带视为1个位点,用QualityOneSoflware统计位点总数和多态位点数。按条带有或无别离赋值,有带记为1,无带记为0。按Nei&Li(1979)方式计较材料间遗传类似系数(GS)。计较公式为:GS=2Nij/(Ni+州),此中NU为材料i和J共有的扩增片段数目,Ni为材料i中呈现的扩增片段数目,Nj为j材猜中呈现的扩增片段数目。按不加权成对群算术平均法(UPGMA)进行遗传类似聚类。统计阐发正在NTSYS—pc软件系统下运转(Rohlfl993)。lg4成果取阐发4.1醇溶卵白标识表记标帜阐发4.1.1属间醇溶卵白多态性鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属19份材料具有很较着的醇溶卵白多态性。19份材料生75条迁徙率分歧的醇溶卵白带纹,均为多态性带(表4)。共分手出191条带纹,平均为lO.1条,变化幅度为6~17条。鹅不雅草属6~11条带纹,平均为9.0条,迁徙率变化幅度为0.728~O.815.平均为0.774:披碱草属6~11条带纹,平均为9.3条,迁徙率的变化幅度为0.859~0.935,平均为0.884;猬草属6~10条带纹,平均为8.3,迁徙率的变化幅度为O,630~0.826.平均为O。724,Hduthiei和Hduthieissp.10ngearistata各分手出9条和6条带纹,(.)区带纹较少,且迁徙率最小,其最大迁徙率别离为O.630和O.717;伸彬草属12~17条带纹,平均为14.3,迁徙率的变化幅度为0.561~O.634,平均为0.604,6/区带纹较其他属多,Y和8区带纹宽且着色较深(图1)。可见,鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属分手出的醇溶卵白带纹正在数量、着色深浅和迁徙率等方面具有较着差别。4.1.2属内种问醇溶卵白多态性Rjaponens妇、R.ciliaris带型类似,表示出较近的亲缘关系。R.grandis分手出l条性带纹,位于Y区。R.eytrigioides、R.alashanica各分手出9条和6条带纹,大部门着色较浅,取其它的供试鹅不雅草属存正在较着的醇溶卵白遗传差别。Esibiricus正在所有供试中迁徙最远,为O.935。Ecaninus分手出的带纹较少。Esibiricus和£caninus正在Y区无带纹分布。Hpatula分手出带纹数目较多,§区和q区带纹宽且着色较深,迁徙也较Hduthiei和Hduthieissp.10ngearistata远。4份仲彬草属材料统一区的带纹着色深浅不异,但Kgobicota迁徙较其他3个远,表白它取其他3个之间醇溶卵白遗传差别较大。4.1.3遗传类似系数操纵75条迁徙率分歧的醇溶卵白带纹计较了材料间的遗传类似系数(GS)(表5)。所有材料的GS变化范畴为0~o.500,平均值为O.081。此中鹅不雅草属Rciliaris和R.japonensi之间的GS最大.为0.5。亲缘关系很近。物秘之间的GS为0的现象为71次。表白鹅不雅革属、披碱草属、猬草属和仲彬草属间具有很较着的遗传差别。94.1.3聚类阐发按照遗传类似系数按UPGMA法进行聚类阐发,构成聚类图(图2)。成果表白:操纵醇溶卵白标识表记标帜能将19份材料完全区分隔。以GS值O.074为闽值,能够将所有供试材料划分为4类。猬草属爿=duthiei、爿=duthiei ssp.10ngearistata两个材料聚为I类,它们的形态类似,具有Ns染色体组。仲彬草属置gobicola、尼rigidula、K mutica和脚melanthera 4个材料聚为II类,其染色体组为StYP。脚gobicola零丁聚类,取脚rigidula、脚mutica和丘melanthera关系较远。披碱草属的4份材料和猬草属的模式种Hpatula聚为III类,具有StH染色体组,仅Enutans具StYH染色体组。鹅不雅草属的8个聚为Ⅳ类,分为3个亚类。Iva亚类包罗具有StY染色体组的R.caucasica、Rciliaris、R.amurensis、R.japonens括和具有StYH染色体组的R.kamojf:iVb亚类包罗R.alashanica、R.etytrigioides 2个,它们的染色体组构成只要St,不具有Y染色体组;Ⅳc亚类只要R.grandis1个。表4醇溶卵白带纹的数目、迁徙率及其分布图1醇溶卵白图谱。1-19为供试鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属, 20为对照中国春(编号同表1)Oma“日∞O朋Oj4图21 9份鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属材料基于醇溶卵白标识表记标帜遗传类似关系的聚类图2l小一ooo.一∞『I卜二心一n一甘一n—N逐个一。一凸8兽昌8:宝88兽:兮昌窖8∞8瓮=S8g苫oo8苫兽g8卜8瓮答焱蜀8景星gg昌菩罄8寸oo o器ggg8昌88g窨害窨窨n+^∞ov辕垛奎罂啦魁瞄蜂皿蛳艇姑厘亲奄墨~塾逻量~闭日誊s壹q是b£挚毒七∽_【8高罱2兽8888宕g昌8苫:兮8善嚣封嚣墨暮量晷量量晷謇量善喜基晷善莩蛩兰銎三量謇誊善量营§善晷詈量晷一ooooooooooooooooo萋鹭薹骂夏§譬銎运冀。善器。萎晷晷基晷基沉4.2RAMP标识表记标帜阐发4.2.1 RAMP的多态性用160个引物组合对随机选用的两个材料进行PCR扩增,43个引物组合能发生条带。操纵43个引物组合对所有供试材料进行多态性检测,从中筛选出谱带清晰并呈多态的引物组合31个,用于扩增成果统计阐发(表6)。31个引物组合生286条带,均具有多态性,占100%,分歧引物组合的扩增条带数变幅为5~14条,平均每个引物扩增出9.2条带。图3是引物组合GC(CA)4和OPBl6的扩增成果。表白鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的RAMP标识表记标帜的多态性高,属间变异大。4.2.2遗传类似系数操纵31个RAMP引物组合发生的286条扩增带计较了材料间的遗传类似系数(GS)(表8)。所有材料的GS变化范畴为O.077~0.957,平均值为0.368。此中,仲彬草属丘thoroldiana和脚mutica之间的GS最大,为0.957,亲缘关系很近;猬草属Hduthiei和仲彬草属墨gobicola之间GS最小,为O.077,亲缘关系最远。表6RAMP引物组合和扩增成果引物对全数位点多态位点引物对全数位点多态位点GC(CA)4+OPAI88GC(CA)t+OPBll88GC(CA)a+OPA388GC(CA)d+OPBl41010GC(CA)4+OPA51111GC(CA)4+OPBl688GC(CA)4+OPA699GC(CA)4+OPBl788GC(CA)4+OPA71010GC(CA)j+OPBl899GC(CA)4+OPAlI1010GC(CA)a+OPBl977GC(CA)4+OPAl288GC(CA)4+OPB2077GC(CA)4+OPAl31111GT(CA)4+OPH31010GC(cA)4+OPAl51414GC(CA)d+OPHl51212GC(CA)4+OPAl799GC(CA)t+OPH588GC(CA)4-FOPAl899GT(CA)4-I-OPH455GC(CA)4+OPAl988GT(CA)4+OPHl31212GC(CA)d+OPBl1313GT(CA)d+OPHl899GC(CA)4+OPB21313GC(CA)4+OPR777GC(CA)4+OPB699GT(CA)4+OPR588GC(CA)4-I-OPR888Iotal286286图3RAMP引物GC(cA)4+OPBl6对23份鹅不雅草属、披碱草属、狷草属和仲彬草属物州JPCR扩增图谱(材料编号同表2,M代表GeneRulerTM100bpDNALadderPlusmarker)鹅不雅草属、披碱草属、猬草和仲彬草属的属内各类间以及4个属的属间平均遗传类似系数和变化幅度列于表7中。鹅不雅草属和披碱草属属间GS变幅为O.130~0.450,平均为0.277:鹅不雅草属和猬草属属间GS变幅为0.088~0.495,平均为O.258;鹅不雅草属和仲彬草属间GS变幅为O.098~0.467,平均为O.252。披碱草属取猬草属属间GS变幅为0.113~0,625,平均为0.312:披碱草属取仲彬草属属间GS变幅为O.087~O.342,平均为O.312。猬草属取仲彬草属属间GS值变幅为O.077~0.282:平均为0.160。鹅不雅草属种问平均类似系数为O.398,变化幅度为0.182~0.867;披碱草属的种间GS平均值为O.465.变幅为0.185~0.632;猬草属的种间GS平均值为0.409,变幅为O.170~O.624;仲彬草属的种间GS平均值为O.683,变幅为O.500~0.957。属内种间的GS值大于属间GS值。成果表白按照RAMP材料统计的鹅不雅草属、披碱革属、猬草和仲彬草属的属间及属内种间平均遗传类似系数和变化幅度变化较大。4.2.3聚类阐发按照遗传类似系数按UPGMA法进行聚类阐发,构成聚类图(图4)。成果表白:操纵RAMP标识表记标帜能将23份材料完全区分隔。以GS值O.33为阈值,能够将所有供试材料划分为4类。这4类别离代表鹅不雅草属、披碱草属、猬草和仲彬草属4个属,且patula破例。猬草属Hduthiei、1-[duthieissp.10ngearistata两个材料聚为I类,它们的形态类似,具有Ns染色体组,别离来历于中国和日本。仲彬草属Kgobicola、尼thoroldiana、五mutica、丘melanthera和脚rigidula5个材料聚为Ⅱ类,其染色体组为StYP。脚gobicola分布于新疆南部,疏穗,零丁聚类,取分布于青海、甘肃和四川川西高原的世thoroldiana、咒mutica、K melanthera和托rigidula的关系较远,而尼thoroldiana徊置mutica聚类正在一路,遗传类似系数最高,为O.957,它们的形态类似,分布正在一路,亲缘关系很近。披碱草属的5份材料和猬草属的模式种Hpatula聚为III类,具有StH染色体组,仅Enutans具StYH染色体组。鹅不雅草属的10个聚为Ⅳ类,较着分为3个亚类。IVa亚类包罗具有StY染色体组的R.caucasica、R,ciliaris、尼amurensis、R.japonens括、R.aristiglumis和具有StYH染色体组的R.kamoji,除鹅不雅草属的模式种R.caucasica来历于亚美尼亚外,其余来历于中国;IVb亚类只要R。grandis1个;IVe亚类包罗R.alashanica、R.elytrigioides和R.magnicaespes 3个,它们的染色体组构成只要St,不具有Y染色体组。表7按照RAMP材料统计的鹅不雅草履、披碱草属、猬草和仲彬草属的属问及属内种间平均遗传类似系数和变化幅度RoegneriaElymusHystrixKengyiliaRoegneria0.396(0.I82-0.867)Elymus0.2770.465(0.130-0450)(0.185-0.632)Hystrix0.2580.3 120.409(0.088·0.495)(0.113—0.625)(0.170·0.624)Kengyilia0.25202110.1600.683(O.098-0467)(0.087·0.342)(O.077·0.282)(O.500·0.957)cauc越1伯dntr括肇∞e璐1s抽眦甚州Hj&rixtJfdⅢ出hlojitr∞越s tlt吐lnieaeJytriioi如I地mc拈犟ss sibzngILtC0212脚jan种oJeturnl,fwt皂q列tOn四patl£tobi∞h伯D,ajdona._tufdceJej毫州呐e,orisid吐edutl血iJoagRa:zxtnt#CottlEit埘图4 23份鹅不雅草属、披碱草厘、猬草属和仲彬草属材料基于R^糖遗传类似关系的聚类图§誊善一。童嚣墨善晷吾寰一ooo謇景景囊娶一oooo晷§兰曼曼墓一ooooo晷蓉警蛩萎型蒌一oo oooo量呈暑浴蓦划§垦一ooooooo营銎曼蟊嚣蕊蕊嚣蟊一0ooooooo謇g暑蜀童赋骂毫蜀若一ooooooooo晷孽誊蓑兰墨嚣望兰奢望一口ooo oooo oo善葺荨导萎嚣晶墨是暑蓦至一ooooooooooo謇甍曼景最蟊基誉望封至里萎一ooooooodoooo善茜女嚣Si莩=r,li望§S目!一oooooo6o 6doo o晷点再禹蕊兰聂禺蕊蒌墨墨墨墨兰一ooooooooo6oood§i i§西§是:蚕目§笙三E!三一oooooo ooodooooo謇毫量誊S兰基嚣星§毯若罾呈銎兰墨一oooooooooooooooo善i§§!星i言s霉譬善蕊翕蕊景嚣善营一ooooooooo6dodo i苦若*^∞ov赣垛弩粤职剿(1苫盏厘蒌羹童f『塾莲点色晕寸妻_^寄窘b譬警毒}nN∞噼善i!§至i!型三萎封暑呈薹善§;荨星一oooooooooodo ddd言古d晷l;!!§至蟊矗写基暮§誊暑遣赢甍蟊蒜一oooooooooododdddd苦苦謇§!§§量矍墨曼莲写曩熹驾莒曩嗣嚣蕊鑫一oooooooo o6o6od占d苦若苦苫量§l§女§§§≤三善爵嚣鹭每焉暑羞謇翳驽基一ooooo ooooooodd6d6 od d孑0懈匾即世忿彝g僻车妒世nNI一。蜊.§§§§§§§§§§§§§§g§§g§§§§一n·n畸^*矗宝=垡0::212兰曼竞=魁盈4.3细胞质基因组POR-RFLP阐发4.3.1PCR-RFLP多态性操纵3个叶绿体和3个线粒体通用引物扩增鹅不雅草属、披碱草属、猬草和仲彬草属共23份材料和l份外类群(通俗小麦TriticumaestivumL.)的cpDNA和mtDNA上响应区域。统一引物对24材料的扩增片段长度不异。扩增片段用AvaI、BamHI、EcoRI、EcoRV、Ecll36II、HaelII、Hin61、npaII、H/nil,KpnI、nfI、RsaI、TaqI、XhoI共15种性内切酶进行酶切。正在65种引物/酶组合中,19种组合无酶切产品,占29%。正在其余46种引物/组合中,共检测到356条DNA片段,此中32l条具有多态性,占90.2%(表9)。引物r,月HK的PCR扩减产物图经性内切酶HaeIII消化后的电泳图谱见图5A,B。成果表白鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属细胞质基因组间存正在较着差别。图5引物trnHK的PCR扩减产物图(A)经性内切酶亡&醒III消化后的电泳图谱(B)。(1—23材料编号同表2,24代表通俗,J唛,M代表G翎eRlllerTM100bpDNALadderPlusmarker)蚺柏趔。o。。一。戎叫罐赧—逐个蚺怕掣一ho。一q由蠢蘧辐h—一蚺搀掣oo一暑h躏赧N—蚺怕掣口o—n一々童躏赧oNn蚺抬簟口to一、迁躜辐∞:m—蚺柏掣t.々o一≈鱼¥锄裁t一蚺柏掣o卜∞n西一_,≤蹈裁N∞∞n奇蚺怕型H一∞o—崞逐个≈且王踊耦nN∞o—崎蚺娟掣卜昏o卜一b≈—≈增氟o“卜西一卜蚺恂掣口。一。一甘。一量~—王堪鼎n。一。一寸。一蚺柏掣—。。II∞cI_由瑚赫H逐个蚺确掣cI咔婚犀铠黑饔棼噬褂鞋晕冥噻擗熙,噬褂譬辎,噬褂饔嚣$nN靛耻蜷d]&士ol《o国踊巅cI明日抬掣≈。。一岳。由锄籁t.逐个蚺柏掣N。m=Ic∞*口m。:。一。一∞口a。一z翰墨确赧n一a一蚺怕掣A一譬飞蹈蒜t.tg匝醐蜓丞导÷。o咐因琳)I薹.}{董Ub早∞歪1k8A勰嚣::∞n.∞∞_l 《,-I√I】4.3.2遗传类似系数操纵46种引物/组合检测到356条的DNA片段计较了材料间的遗传类似系数(GS)(表11)。所有材料的GS变化范畴为0.621~O.904,平均值为0.737。此中,猬草属Hdu胁iei和Hdu腩ieissp.fD愕e口r括胁m之间的GS最大,为0.904。亲缘关系很近;鹅不雅草属R.amurens括和猬草属1t.patu,口之间GS最小,为O.628,亲缘关系最远。23份供试取外类群之间的GS变化范畴为O.601~O.687。按照表11计较鹅不雅草属、披碱草属、猬草和仲彬草属的属内各类间以及4个属的属间平均遗传类似系数和变化幅度,列于表lO中。鹅不雅草属和披碱草属属间GS变幅为O.705~0.815,平均为0.670;鹅不雅草属和猬草属属间GS变幅为0.634~0.792,平均为O.63l;鹅不雅草属和仲彬草属属间GS变幅为O.634~740,平均为O.713。披碱草属取猬草属属间GS变幅为O.719~0.832,平均为0.766:披碱草属取仲彬草属属间O.617~0.825,平均为0.704。猬草属取仲彬草属属间GS值变幅为0.629~0.795;平均为0.743。正在鹅不雅草属中,种间平均类似系数为0.720,变化幅度为O.670~0.868:正在披碱草属的种间GS平均值为0.810,变幅为O.764~0.846:猬草属的种间GS平均值为O.837,变幅为O.792~0.904:仲彬草属的种间GS平均值为O.786,变幅为O.739~O.827。属内种间的GS值大于属间GS值。成果表白按照PCR.RFLP材料统计的鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的属间及属内种间平均遗传类似系数较高,变化幅度较小。表10按照PCR-RFLP材料统计的鹅不雅草属、披碱草属、猬草和仲彬草属的属间及属内种间平均遗传类似系数和变化幅度RoegneriaE咖mⅪHystrixKengyilia0.720Roegnerm(0.670~0.868)0.6700.810Elymus(0.705-0.815)(0.764,–0.846)0.6310.7660.837Hvs律ix(o.634–0.792)(O.719~o.832)(0.792.-0.904)0.7130.7040.7430.786Kengyilia(0.634—740)(0.617~0.825)(0.629-.0.795)(0.739–0.82)l§l§Il§lll星骂嚣再嚣一oooo!l!§§i量誉车睾誊釜i—oooooo§l!li§l2§;lgll§l§lglI§lll;l§l§;lllllli§lllglllllli§il§§ll§lllli§i§llll;illlll*^∽ov籁垛叠罂送螋山一臣&u山厘亲蒸童_f塾辽,墨毛蚤§§§lll§llli§lll!g;gll;lliil§ll§§;§lll§lllgll§l§§§§llg§lii§llll§l§§§l§lllil;l§lill§§§l—ol§lo々olo々々ol§!loioloi§id4{{{6{dlll§lligllllillllll§l§ll§;§§l l g§l§l§§§§i§§i§§§§j§§§l§llll§§§lll§§l§ll§11一巨§ll§glllll§l§l§§§§lll§ll逐个n甘叽心卜∞夺皇=22==一L,O==曼高再箱简葛0.一&s》鼍&≈§s皇,Rv枯糕隶最葛.N懈匾_旨监嚣嚣露琳芒妒世nr一。燃.4.3.3聚类阐发按照细胞质基因组PCR.RFLP标识表记标帜遗传类似系数(GS)(表11)矩阵,采用UPGMA建立聚类图(图6)。以0.54为闽值,24份材料聚为5类。此中23份鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属材料可划分为4类,1个外类群零丁聚为一类。仲彬草属脚gobicola、Kthoroldiana、脚mutica、尼melanthera和脚rigidula5个材料聚为I类。5个披碱草属材料、3个猬草属材料和1个鹅不雅草属R.kamoli聚为II类,此中H duthiei、Hduthieissp./ongear打tata聚类正在一路,亲缘关系很近。鹅不雅草属R.grandis、Raristigl“m打,R.etytrigioides、R.alashanica、R.magnicaespes聚为ⅡI类。R.caucasica、R.ciliar&、R.amurensis、R.japonensis聚为Ⅳ类。cili叫sJ删,JensJjFj∞dis instisiredsalashardcaei”n毫从oidskmjifoⅢt∞1Ⅱ jofu,口鲥birif∞』a口D∞』dtuF由t^“dlangearistata Eoblcolntharoldi册nⅢfjfd:nel舶thca-nri匹dula4estiv啪图623份鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和伸彬草属材料基于细胞质基因组POR-RFLP遗传类似系数的聚类囤5会商5.1属间关系鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的形态有较着的区别。保守分类上鹅不雅草属Roegneria取披碱草属Elymus的区别正在于:Roegneria的每个穗轴节上仅着生1个小穗,而Elymus每穗轴节上着生2个小穗。但这个性状有变异,正在肥饶的前提下偶见Roegneria一些的每穗轴节上着生多个小穗,而Elymus的一些每一穗轴节的小穗单生。猬草属Hystrix每穗轴上着生2个小穗,但颖强烈退化以至缺失。仲彬草属Kengyilia的小穗单生,但穗轴节间短,花序慎密,外稃密生柔毛或糙毛,无芒或短芒。Baum et a1.(1995)通过数理形态分类认为Kengyilia、Agropyron、Etymus、Roegneria属间边界较为较着。细胞学上,Roegneria的模式种R.caucasica具StY,Elymus的模式种Esibiricus具StH染色体组,Hystrix的模式种Hpatuta具StH,而Kengyilia的模式种Kgobicota具有StYP染色体组。L6ve(1984)和Dewey(1984)等以染色体组做为划分小麦族属的尺度,为小麦族一些属的边界、属种系统发源和演化供给了靠得住的材料。但正在具体处置过程中,对属的边界仍存正在着不合。Jensenet a1.(1996、琴等(2002)研究报道Hystrix除模式种Hpatula具StH染色体组外,其它一些具有Ns染色体组,取赖草属和新麦草属的Ns染色体组类似。Dewey和L6ve界定的Elymus品种良多(包罗Roegneria),含有st、Y和H等染色体组组合的,约有150多种(L6ve1984;Dewey1984)。正在Roegneria中,有的只要st染色体组,如无芒类群的尺.alashanica和R.elytrigioides,应属于拟鹅不雅草属Pseudoroegneria。因而,正在保守形态分类和细胞分类根本上,采用多种研究手段分析研究这四个属的系统地位和亲缘关系,将为最终小麦族系统分类研究的辩论和不合供给材料。本研究的醇溶卵白标识表记标帜的成果表白:鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属的醇溶卵白带纹正在数量、着色深浅和迁徙率等方面具有较着差别,间醇溶卵白多态性较高。共分手出191条带纹。平均为10.1条,变化幅度为6~17条。鹅不雅草属6~1l条带纹,平均为9.0条,迁徙率变化幅度为0.728~O.815,平均为0.774:披碱草属6~1l条带纹,平均为9-3条,迁徙率的变化幅度为O.859~0.935。平均为0.884;猬草属6~10条带纹,平均为8.3,迁徙率的变化幅度为0.630~0.826。平均为0.724,Hduthiei和爿:duthieissp.10ngearmtata各分手出9条和6条带纹,(.)区带纹较少,且迁徙率最小,其最大迁徙率别离为0.630和0.717;仲彬草属12~17条带纹,平均为14.3,迁徙率的变化幅度为0.561t0.634,平均为0.604,∞区带纹较其他属多,Y和B区带纹宽且着色较深(图1)。总体上,鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属属间醇溶卵白谱带变异大于属内种间变异,统一属的醇溶谱带的类似程度大于分歧属间的谱带。聚类阐发成果表白,供试鹅不雅草属、披碱草属和仲彬草属各自聚为一类,这四个属间存正在较着的遗传差别。跋扈草属模式种Hpatula和披碱草属聚类正在一路,亲缘关系较近:而Hduthiei和Hduthieissplongeristata零丁聚为一类,它们含有Ns染色体组,表白取供试的其它间具有很较着的遗传差别。因而,鹅不雅革属、披碱草属和仲彬革属别离属分类品级处置是得当的,猬草属的分类地位有待进一步研究。操纵RAMP标识表记标帜的材料进行的聚类阐发的成果表白:鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属间存正在较着的遗传差别,它们各自聚类正在一路。猬草属模式种Hpatula取披碱草属的5个聚类正在一路,表示出较近的亲缘关系:而别的的两个Hduthiei和Hduthieissp.10ngearistata具有Ns染色体组,零丁聚为一类,表白取供试的其他的亲缘关系较远,具有很显著的遗传差别。具有st,不具有Y染色体组的Roegneria无芒类群的R.alashanica、Relytrigioides和脚magnicaespes聚类正在一路,取其它鹅不雅草属分隔。可见,RAMP标识表记标帜的成果取醇溶卵白标识表记标帜的成果根基分歧,支撑把鹅不雅草属、披碱草属和仲彬草属做为属分类品级来处置。对于猬草属的系统地位,有待对其所有进行系统研究和分类处置后,才能做出结论。细胞质基因组PCR.RFLP阐发的成果表白:仲彬草属零丁聚为一类,鹅不雅草属R.grandis、R.aristiglumis、R.elytrigioides、R.alashanica、R.magnicaespes聚为一类,R.caucasica、R.ciliaris、R.amurensis、R.japonens括聚正在一路。这些成果取等(2001)对鹅不雅草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属进行的RAPD阐发的成果和本研究的醇溶卵白标识表记标帜、RAMP阐发

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